恒(heng)奧(ao)德儀(yi)器(qi)紫(zi)外(wai)分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)儀(yi)器(qi)組成(cheng) 測(ce)定(ding)方(fang)法(fa)

儀(yi)器(qi)組成(cheng)

分光(guang)光(guang)度計(ji)已(yi)經(jing)成(cheng)為現(xian)代分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)實(shi)驗室(shi)常規儀(yi)器(qi)。常用於(yu)核酸，蛋白(bai)定(ding)量(liang)以及細(xi)菌生(sheng)長(chang)濃(nong)度的定(ding)量(liang)。

儀(yi)器(qi)主要(yao)由光(guang)源(yuan)、單色器(qi)、樣(yang)品(pin)室(shi)、檢測(ce)器(qi)、信(xin)號處(chu)理器(qi)和顯示與存(cun)儲系統(tong)組(zu)成(cheng)。

光(guang)譜(pu)範(fan)圍(wei)

包(bao)括波(bo)長(chang)範(fan)圍(wei)為400~760 nm的(de)可(ke)見光(guang)區(qu)和波(bo)長(chang)範(fan)圍(wei)為200～400 nm的(de)紫(zi)外(wai)光(guang)區(qu)。不同的(de)光(guang)源(yuan)都有(you)其*的(de)發射光(guang)譜(pu),因此(ci)可(ke)采(cai)用不(bu)同的(de)發光(guang)體(ti)作(zuo)為儀(yi)器(qi)的光(guang)源(yuan)。

分光(guang)光(guang)度計(ji)圖片(pian)

分光(guang)光(guang)度計(ji)圖片(pian)(4張)

鎢(wu)燈(deng)的(de)發射光(guang)譜(pu):鎢(wu)燈(deng)光(guang)源(yuan)所發出(chu)的(de)400～760nm波(bo)長(chang)的光(guang)譜(pu)光(guang)通(tong)過三棱鏡(jing)折射後,可(ke)得(de)到由(you)紅橙(cheng)，黃綠(lv)，藍靛，紫(zi)組(zu)成(cheng)的連(lian)續色(se)譜(pu);該(gai)色譜(pu)可(ke)作(zuo)為可(ke)見光(guang)分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)的(de)光(guang)源(yuan)。

氫(qing)燈(deng)（或氘(dao)燈）的(de)發射光(guang)譜(pu):氫(qing)燈(deng)能發出(chu)185～400 nm波(bo)長(chang)的光(guang)譜(pu)可(ke)作(zuo)為紫(zi)外(wai)光(guang)光(guang)度計(ji)的(de)光(guang)源(yuan)。

蛋白(bai)質(zhi)的(de)直(zhi)接(jie)定(ding)量(liang)（UV法(fa)）

這種方(fang)法(fa)是在(zai)280nm波(bo)長(chang)，直接(jie)測(ce)試蛋白(bai)。選(xuan)擇(ze)Warburg 公(gong)式(shi)，光(guang)度計(ji)可(ke)以直接(jie)顯示出(chu)樣(yang)品(pin)的濃(nong)度，或者(zhe)是選(xuan)擇(ze)相應(ying)的換算方(fang)法(fa)，將吸(xi)光(guang)值(zhi)轉換為樣(yang)品(pin)濃度。蛋白(bai)質(zhi)測(ce)定(ding)過程非(fei)常簡單(dan)，測(ce)試空白(bai)液，然(ran)後直(zhi)接(jie)測(ce)試蛋白(bai)質(zhi)。由(you)於(yu)緩(huan)沖液中存在(zai)些(xie)雜質，般要(yao)消(xiao)除(chu)320nm 的(de)“背(bei)景(jing)"信(xin)息，設(she)定(ding)此(ci)能“開"。與測(ce)試核酸類(lei)似，要(yao)求(qiu)A280的吸(xi)光(guang)值(zhi)至少(shao)大於(yu)0.1A，佳(jia)的(de)線(xian)性範(fan)圍(wei)在(zai)1.0-1.5 之(zhi)間(jian)。實(shi)驗中選擇(ze)Warburg 公(gong)式(shi)顯示樣(yang)品(pin)濃度時，發現讀(du)數“漂(piao)移"。這(zhe)是個正(zheng)常的現(xian)象。事(shi)實(shi)上(shang)，只(zhi)要(yao)觀(guan)察A280的吸(xi)光(guang)值(zhi)的變(bian)化(hua)範(fan)圍(wei)不(bu)過1%，表(biao)明結果非(fei)常穩定(ding)。漂(piao)移的(de)原因是因為Warburg 公(gong)式(shi)吸(xi)光(guang)值(zhi)換算成(cheng)濃度，乘以定(ding)的(de)系數，只要(yao)吸光(guang)值(zhi)有(you)少(shao)許(xu)改變，濃(nong)度就會被放(fang)大，從而(er)顯得(de)結果很(hen)不(bu)穩定(ding)。蛋白(bai)質(zhi)直(zhi)接(jie)定(ding)量(liang)方(fang)法(fa)，適合測(ce)試較純凈、成(cheng)分相(xiang)對(dui)單的(de)蛋白(bai)質(zhi)。紫(zi)外(wai)直(zhi)接(jie)定(ding)量(liang)法(fa)相對(dui)於(yu)比色(se)法(fa)來說(shuo)，速度快(kuai)，操(cao)作(zuo)簡單(dan)；但是容(rong)易(yi)受(shou)到(dao)平(ping)行(xing)物(wu)質(zhi)的(de)幹擾(rao)，如DNA的(de)幹擾(rao)；另外(wai)敏感度低(di)，要(yao)求(qiu)蛋白(bai)的(de)濃(nong)度較。

比色(se)法(fa)蛋白(bai)質(zhi)定(ding)量(liang)

蛋白(bai)質(zhi)通(tong)常是多(duo)種蛋白(bai)質(zhi)的(de)混合物(wu)，比色(se)法(fa)測(ce)定(ding)的(de)基(ji)礎是蛋白(bai)質(zhi)構(gou)成(cheng)成(cheng)分：氨(an)基(ji)酸（如酪(lao)氨(an)酸，絲氨(an)酸）與外(wai)加的(de)顯色基(ji)團(tuan)或者(zhe)染(ran)料反(fan)應，產(chan)生(sheng)有(you)色物(wu)質。有(you)色物(wu)質的濃度與蛋白(bai)質(zhi)反(fan)應的(de)氨(an)基(ji)酸數目(mu)直接(jie)相(xiang)關，從(cong)而(er)反(fan)應蛋白(bai)質(zhi)濃(nong)度。

測(ce)定(ding)方(fang)法(fa)

比色(se)方(fang)法(fa)

般有(you)BCA，Bradford，Lowry 等幾(ji)種方(fang)法(fa)。

Lowry 法(fa)：以早(zao)期(qi)的Biuret 反(fan)應為基(ji)礎，並(bing)有(you)所改。蛋白(bai)質(zhi)與Cu2 反(fan)應，產(chan)生(sheng)藍色的反(fan)應物(wu)。但是與Biuret 相(xiang)比，Lowry 法(fa)敏感(gan)性更。缺(que)點是需要(yao)順(shun)序(xu)加入(ru)幾(ji)種不同的(de)反(fan)應試劑(ji)；反(fan)應需要(yao)的時(shi)間較(jiao)長；容易(yi)受(shou)到(dao)非(fei)蛋白(bai)物(wu)質(zhi)的(de)影(ying)響；含(han)EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等(deng)物(wu)質的蛋白(bai)不(bu)適合此(ci)種方(fang)法(fa)。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法(fa)：這是種較新(xin)的(de)、更(geng)敏感的(de)蛋白(bai)測(ce)試法(fa)。要(yao)分析(xi)的蛋白(bai)在(zai)堿(jian)性溶(rong)液裏與Cu2 反(fan)應產(chan)生(sheng)Cu ，後(hou)者(zhe)與BCA形(xing)成(cheng)螯(ao)合物(wu)，形(xing)成(cheng)紫(zi)色(se)化(hua)合物(wu)，吸(xi)收峰(feng)在562nm波(bo)長(chang)。此(ci)化(hua)合物(wu)與蛋白(bai)濃(nong)度的線(xian)性關系較強，反(fan)應後(hou)形(xing)成(cheng)的化(hua)合物(wu)非(fei)常穩定(ding)。相(xiang)對(dui)於(yu)Lowry法(fa)，操作(zuo)簡單(dan)，敏感度。但是與Lowry法(fa)相似(si)的是容(rong)易(yi)受(shou)到(dao)蛋白(bai)質(zhi)之(zhi)間(jian)以及去(qu)汙劑(ji)的幹(gan)擾(rao)。

Bradford 法(fa)：這種方(fang)法(fa)的原理(li)是蛋白(bai)質(zhi)與考馬斯(si)亮(liang)蘭(lan)結合反(fan)應，產(chan)生(sheng)的(de)有(you)色化(hua)合物(wu)吸(xi)收峰(feng)595nm。其大的特點是，敏(min)感度好(hao)，是Lowry 和(he)BCA 兩種測(ce)試方(fang)法(fa)的2 倍(bei)；操作(zuo)更簡(jian)單，速度更快(kuai)；只(zhi)需要(yao)種反(fan)應試劑(ji)；化(hua)合物(wu)可(ke)以穩定(ding)1小(xiao)時(shi)，方(fang)便(bian)結果；而(er)且(qie)與系列幹(gan)擾(rao)Lowry，BCA 反(fan)應的(de)還原劑(ji)（如DTT，巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇）相(xiang)容(rong)。但是對(dui)於(yu)去(qu)汙(wu)劑(ji)依然(ran)是敏(min)感的(de)。主要(yao)的缺(que)點是不(bu)同的(de)標(biao)準(zhun)品會導致(zhi)同樣(yang)品(pin)的結果差(cha)異(yi)較大，無可(ke)比性。