HAD-V5YX 分(fen)光光(guang)度計(ji)原(yuan)理操作(zuo)方法

原(yuan)理

分(fen)光光(guang)度計(ji)采(cai)用(yong)個(ge)可(ke)以產生多個(ge)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)源(yuan)，通(tong)過(guo)系(xi)列(lie)分光(guang)裝置，從而(er)產生特定波(bo)長(chang)的(de)光(guang)源(yuan)，光(guang)線透(tou)過(guo)測試的(de)樣品後，分(fen)光(guang)線被(bei)吸(xi)收，計(ji)算(suan)樣品的(de)吸(xi)光值(zhi)，從而(er)轉化(hua)成樣品的(de)濃(nong)度。樣品的(de)吸(xi)光值(zhi)與樣品的(de)濃(nong)度成正(zheng)比(bi)。

單(dan)色(se)光輻射(she)穿(chuan)過被(bei)測物(wu)質(zhi)溶液(ye)時(shi)，被(bei)該(gai)物質(zhi)吸收(shou)的(de)量(liang)與該(gai)物質(zhi)的(de)濃(nong)度和(he)液(ye)層的(de)厚(hou)度（光路(lu)長(chang)度）成正(zheng)比(bi)，其(qi)關(guan)系(xi)如下(xia)式(shi)：

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

式(shi)中(zhong) :A 為(wei)吸光度；

I0為(wei)入(ru)射(she)的(de)單(dan)色(se)光強度；

I 為(wei)透(tou)射(she)的(de)單(dan)色(se)光強度；

T 為(wei)物質(zhi)的(de)透(tou)射(she)率(lv)；

k 為(wei)摩爾吸收系數；

L 為(wei)被(bei)分(fen)析物(wu)質(zhi)的(de)光(guang)程，即(ji)比(bi)色(se)皿的(de)邊長(chang)；

c 為(wei)物質(zhi)的(de)濃(nong)度；

蛋(dan)白(bai)質(zhi)的(de)直接定量(liang)（UV法）

這(zhe)種方法是(shi)在280nm波(bo)長(chang)，直接測試蛋白(bai)。選擇(ze)Warburg 公式(shi)，光(guang)度計(ji)可(ke)以直接顯示(shi)出樣品的(de)濃(nong)度，或者(zhe)是(shi)選擇(ze)相(xiang)應的(de)換(huan)算(suan)方法，將(jiang)吸(xi)光(guang)值(zhi)轉換(huan)為(wei)樣品濃(nong)度。蛋白(bai)質(zhi)測定過程(cheng)非常簡(jian)單(dan)，測試空(kong)白(bai)液，然(ran)後直接測試蛋白(bai)質(zhi)。由(you)於緩(huan)沖(chong)液中(zhong)存在些(xie)雜(za)質(zhi)，般要(yao)消除320nm 的(de)“背景(jing)"信(xin)息(xi)，設(she)定此能(neng)“開(kai)"。與測試核酸(suan)類(lei)似，要(yao)求(qiu)A280的(de)吸(xi)光值(zhi)至少大於0.1A，佳(jia)的(de)線性(xing)範(fan)圍在1.0-1.5 之間。實驗(yan)中(zhong)選擇(ze)Warburg 公式(shi)顯(xian)示(shi)樣品濃(nong)度時，發現讀(du)數“漂(piao)移"。這(zhe)是(shi)個(ge)正(zheng)常(chang)的(de)現象。事實上(shang)，只要(yao)觀察(cha)A280的(de)吸(xi)光值(zhi)的(de)變(bian)化(hua)範(fan)圍不過(guo)1%，表明(ming)結果非常穩(wen)定。漂移(yi)的(de)原(yuan)因(yin)是(shi)因(yin)為(wei)Warburg 公式(shi)吸(xi)光(guang)值(zhi)換(huan)算(suan)成濃(nong)度，乘以定的(de)系(xi)數，只要(yao)吸(xi)光值(zhi)有少許(xu)改變(bian)，濃(nong)度就會(hui)被(bei)放大(da)，從而(er)顯得(de)結(jie)果很不穩(wen)定。蛋白(bai)質(zhi)直接定量(liang)方法，適合測試較(jiao)純(chun)凈(jing)、成(cheng)分(fen)相對單(dan)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)。紫外直接定量(liang)法相(xiang)對(dui)於(yu)比(bi)色(se)法來(lai)說(shuo)，速度快，操作(zuo)簡(jian)單(dan)；但是(shi)容(rong)易(yi)受到平行物(wu)質(zhi)的(de)幹(gan)擾(rao)，如DNA的(de)幹(gan)擾(rao)；另外敏(min)感(gan)度低，要(yao)求(qiu)蛋(dan)白(bai)的(de)濃(nong)度較(jiao)。

比(bi)色(se)法蛋(dan)白(bai)質(zhi)定量(liang)

蛋(dan)白(bai)質(zhi)通常(chang)是(shi)多種蛋白(bai)質(zhi)的(de)混(hun)合(he)物(wu)，比(bi)色(se)法測定的(de)基礎(chu)是(shi)蛋白(bai)質(zhi)構(gou)成(cheng)成(cheng)分(fen)：氨基酸(suan)（如酪(lao)氨酸(suan)，絲(si)氨(an)酸）與外加的(de)顯(xian)色(se)基團(tuan)或(huo)者染料反應，產生有色(se)物質(zhi)。有色(se)物質(zhi)的(de)濃(nong)度與蛋白(bai)質(zhi)反應的(de)氨(an)基酸(suan)數目直接相關(guan)，從而(er)反應蛋白(bai)質(zhi)濃(nong)度。

比(bi)色(se)方法

般(ban)有BCA，Bradford，Lowry 等(deng)幾種方法。

Lowry 法：以(yi)早期(qi)的(de)Biuret 反應為(wei)基礎(chu)，並(bing)有所改。蛋白(bai)質(zhi)與Cu2 反應，產生藍色(se)的(de)反應物。但(dan)是(shi)與Biuret 相(xiang)比，Lowry 法敏(min)感(gan)性(xing)更。缺點是(shi)需要(yao)順序(xu)加入(ru)幾種不(bu)同(tong)的(de)反應試劑；反應需要(yao)的(de)時(shi)間較(jiao)長(chang)；容(rong)易(yi)受到非蛋白(bai)物質(zhi)的(de)影響；含(han)EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等(deng)物質(zhi)的(de)蛋(dan)白(bai)不適合此(ci)種(zhong)方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這(zhe)是(shi)種較(jiao)新(xin)的(de)、更敏(min)感(gan)的(de)蛋(dan)白(bai)測試法。要(yao)分(fen)析的(de)蛋(dan)白(bai)在堿(jian)性(xing)溶液裏與Cu2 反應產生Cu ，後者(zhe)與BCA形(xing)成螯(ao)合(he)物(wu)，形(xing)成紫(zi)色(se)化合(he)物，吸(xi)收峰在562nm波(bo)長(chang)。此(ci)化(hua)合(he)物(wu)與蛋白(bai)濃(nong)度的(de)線性(xing)關(guan)系(xi)較(jiao)強，反應後形(xing)成的(de)化(hua)合物(wu)非常穩(wen)定。相對(dui)於(yu)Lowry法，操作(zuo)簡(jian)單(dan)，敏(min)感(gan)度。但是(shi)與Lowry法相(xiang)似(si)的(de)是(shi)容(rong)易(yi)受到蛋(dan)白(bai)質(zhi)之間以及去(qu)汙劑的(de)幹(gan)擾(rao)。

操作(zuo)方法

1.接通電(dian)源(yuan)，打開儀(yi)器開關(guan)，掀(xian)開(kai)樣品室暗(an)箱蓋，預(yu)熱(re)10分(fen)鐘。

2.將(jiang)靈敏(min)度開關(guan)調(tiao)至“1"檔(dang)（若(ruo)零(ling)點(dian)調(tiao)節(jie)器調(tiao)不到“0"時(shi)，需選(xuan)用(yong)較(jiao)。）

3.根(gen)據(ju)所需波(bo)長(chang)轉動(dong)波(bo)長(chang)選(xuan)擇(ze)鈕(niu)。

4.將(jiang)空(kong)白(bai)液及測定液分(fen)別倒入(ru)比(bi)色(se)杯3/4處(chu)，用(yong)擦(ca)鏡(jing)紙(zhi)擦(ca)清外壁(bi)，放入(ru)樣品室內(nei)，使空(kong)白(bai)管對(dui)準(zhun)光(guang)路(lu)。

5.在(zai)暗(an)箱蓋開啟(qi)狀(zhuang)態下(xia)調(tiao)節(jie)零點調(tiao)節(jie)器，使讀(du)數盤針(zhen)向t=0處(chu)。

6.蓋上(shang)暗(an)箱蓋，調(tiao)節(jie)“100"調(tiao)節(jie)器，使空(kong)白(bai)管的(de)t=100，針(zhen)穩(wen)定後逐(zhu)步(bu)拉(la)出樣品滑竿，分(fen)別讀(du)出(chu)測定管的(de)光(guang)密度值，並(bing)記錄(lu)。

7.比(bi)色(se)畢(bi)，關(guan)上(shang)電(dian)源(yuan)，取(qu)出(chu)比色(se)皿洗(xi)凈，樣品室用(yong)軟(ruan)布(bu)或軟(ruan)紙(zhi)擦(ca)凈(jing)。