凱(kai)氏(shi)定(ding)氮(dan)儀(yi)是(shi)根(gen)據蛋白質(zhi)中氮的含(han)量(liang)恒定(ding)的原理(li)，通(tong)過(guo)測定(ding)樣(yang)品(pin)中氮的含(han)量(liang)從而(er)計算蛋白質(zhi)含(han)量的儀(yi)器。因(yin)其(qi)蛋白質(zhi)含(han)量測量(liang)計算的方法(fa)叫(jiao)做凱(kai)氏(shi)定(ding)氮(dan)法(fa)，故被(bei)稱為(wei)凱(kai)氏(shi)定(ding)氮(dan)儀(yi)，又名(ming)定(ding)氮(dan)儀(yi)、蛋白質(zhi)測定(ding)儀(yi)、粗(cu)蛋白測定(ding)儀(yi)。

　　原理(li)

　　將(jiang)有(you)機化合物(wu)與(yu)硫酸(suan)共熱使(shi)其(qi)中的氮(dan)轉化為(wei)硫酸(suan)銨(an)。在這步(bu)中，經(jing)常會(hui)向(xiang)混合物(wu)中加(jia)入(ru)硫酸鉀(jia)來(lai)提(ti)中間產(chan)物(wu)的沸點(dian)。樣(yang)本的分(fen)析(xi)過程的終(zhong)點(dian)很好(hao)判(pan)斷(duan)，因(yin)為(wei)這時混合物會(hui)變(bian)得(de)無(wu)色且透明（開始時很暗(an)）

　　在(zai)得(de)到(dao)的溶(rong)液(ye)中加(jia)入(ru)少(shao)量氫(qing)氧化鈉，然(ran)後蒸(zheng)餾(liu)。這步(bu)會(hui)將(jiang)銨鹽轉化成氨(an)。而(er)總(zong)氨量(liang)（由樣(yang)本的含(han)氮(dan)量直接決定(ding)）會(hui)由反(fan)滴(di)定(ding)法(fa)確定(ding)：冷凝管(guan)的末(mo)端(duan)會(hui)浸(jin)在硼酸(suan)溶(rong)液(ye)中。氨會(hui)和酸(suan)反(fan)應，而(er)過(guo)量(liang)的酸(suan)則(ze)會(hui)在(zai)甲基(ji)橙(cheng)的示(shi)下(xia)用(yong)碳(tan)酸鈉滴(di)定(ding)。滴(di)定(ding)所(suo)得(de)的結(jie)果乘(cheng)以(yi)定(ding)的轉換(huan)因(yin)子就可以(yi)得(de)到(dao)結(jie)果。

　　使(shi)用(yong)步(bu)驟

　　消(xiao)化

　　1、準(zhun)備6個凱(kai)氏(shi)燒(shao)瓶，標號(hao)。1、2、3號(hao)燒(shao)瓶中分別(bie)加(jia)入(ru)適當濃度(du)的蛋白溶(rong)液(ye)1.0mL，樣(yang)品(pin)要(yao)加(jia)到(dao)燒(shao)瓶底，切(qie)勿沾(zhan)在瓶口及(ji)瓶頸(jing)上。再依(yi)次加(jia)入(ru)硫酸鉀(jia)-硫酸(suan)銅接觸(chu)劑(ji)0.3g，濃硫(liu)酸2.0mL，30%過(guo)氧化氫(qing)1.0mL。4、5、6號(hao)燒(shao)瓶作(zuo)為(wei)對(dui)照(zhao)，用(yong)以(yi)測定(ding)試(shi)劑(ji)中可能(neng)含有(you)的微(wei)量(liang)含氮物質(zhi)，對(dui)樣(yang)品(pin)測定(ding)行(xing)校正(zheng)。4、5、6號(hao)燒(shao)瓶中加(jia)入(ru)蒸(zheng)餾(liu)水1.0mL代替(ti)樣(yang)液(ye)，其(qi)余(yu)所(suo)加(jia)試(shi)劑(ji)與1、2、3號(hao)燒(shao)瓶相同。2、將(jiang)加(jia)好(hao)試(shi)劑(ji)的各(ge)燒(shao)瓶放置(zhi)消化架(jia)上，接好(hao)抽(chou)氣裝置(zhi)。用(yong)微(wei)火加(jia)熱(re)煮沸，此(ci)時燒(shao)瓶內物質(zhi)炭(tan)化變(bian)黑(hei)，並產(chan)生(sheng)大(da)量泡沫(mo)，務(wu)註意防止氣(qi)泡沖(chong)出(chu)管(guan)口。待(dai)泡沫(mo)消(xiao)失(shi)停止產(chan)生(sheng)後，加(jia)大(da)火力，保(bao)持瓶內液(ye)體微沸，至溶(rong)液(ye)澄清(qing)後，再繼(ji)續(xu)加(jia)熱(re)使消化液(ye)微沸15min。在(zai)消(xiao)化過程中要(yao)隨(sui)時轉動(dong)燒(shao)瓶，以使內壁粘(zhan)著(zhe)物質(zhi)均(jun)能(neng)入底，以保證(zheng)樣(yang)品(pin)消化。消化時放出的氣(qi)體內含SO2，具(ju)有(you)強烈刺激性，因(yin)此(ci)自(zi)始自(zi)終(zhong)應(ying)打開抽(chou)水泵將氣體抽入(ru)自來(lai)水排出(chu)。整(zheng)個消(xiao)化過程均應(ying)在通(tong)風(feng)櫥(chu)中行。消(xiao)化後，關(guan)閉火焰(yan)，使(shi)燒(shao)瓶冷卻至室(shi)溫。

　　蒸(zheng)餾(liu)吸收

　　蒸(zheng)餾(liu)和吸收是(shi)在微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定(ding)氮(dan)儀(yi)內行的。凱(kai)氏(shi)定(ding)氮(dan)蒸(zheng)餾(liu)裝置(zhi)種類甚(shen)多(duo)，大(da)體上都(dou)由蒸(zheng)氣發生、氨的蒸(zheng)餾(liu)和氨(an)的吸收三(san)分組成(cheng)。

　　1、儀(yi)器的洗滌(di)

　　儀(yi)器安(an)裝前(qian)，各(ge)件需(xu)經(jing)般(ban)方法(fa)洗滌(di)幹(gan)凈(jing)，所用(yong)橡(xiang)皮管(guan)、塞須浸(jin)在10%NaOH溶(rong)液(ye)中，煮約(yue)10min，水洗、水煮10min，再水洗數(shu)次(ci)，然(ran)後安裝並固(gu)定(ding)在(zai)只(zhi)鐵架(jia)臺(tai)上。儀器使(shi)用(yong)前(qian)，微(wei)量(liang)管(guan)道都(dou)須經(jing)水蒸(zheng)氣洗滌(di)，以(yi)除(chu)去管(guan)道內可能(neng)殘留(liu)的氨(an)，正(zheng)在(zai)使(shi)用(yong)的儀(yi)器，每(mei)次測樣(yang)前(qian)，蒸(zheng)氣洗滌(di)5min即可。較(jiao)長時間未使用(yong)的儀(yi)器，重(zhong)復蒸(zheng)氣洗滌(di)，不(bu)得(de)少(shao)於三(san)次(ci)，並檢查儀(yi)器是(shi)否正(zheng)常。仔細(xi)檢查各(ge)個連(lian)接處(chu)，保(bao)證(zheng)不(bu)漏(lou)氣(qi)。在蒸(zheng)氣發生器中加(jia)約(yue)2/3體積蒸(zheng)餾(liu)水，加(jia)入(ru)數滴(di)硫酸(suan)使(shi)其(qi)保(bao)持酸(suan)性(xing)，以避免(mian)水中的氨(an)被(bei)蒸(zheng)出而(er)影(ying)響(xiang)結(jie)果，並放入(ru)少(shao)許沸石(shi)（或毛細(xi)管(guan)等），以防(fang)沸。沿(yan)小(xiao)玻杯壁(bi)加(jia)入(ru)蒸(zheng)餾(liu)水約20mL讓(rang)水經(jing)插(cha)管(guan)入反(fan)應室(shi)，但(dan)玻杯內的水不(bu)要(yao)放(fang)光(guang)，塞上棒狀(zhuang)玻塞，保(bao)持水封，防止漏(lou)氣(qi)。蒸(zheng)氣發生後，立即關(guan)閉廢液(ye)排放(fang)管(guan)上的開(kai)關(guan)，使(shi)蒸(zheng)氣只(zhi)能(neng)入反(fan)應室(shi)，導(dao)致反(fan)應室(shi)內的水迅速沸騰(teng)，蒸(zheng)出蒸(zheng)氣由反(fan)應室(shi)上端口(kou)通(tong)過(guo)定(ding)氮(dan)入(ru)冷凝管(guan)冷卻，在(zai)冷凝管(guan)下端(duan)放置(zhi)個錐形(xing)瓶接收冷凝水。從定(ding)氮(dan)發燙(tang)開(kai)始計時，連(lian)續(xu)蒸(zheng)煮5min，然(ran)後移(yi)開(kai)煤氣燈(deng)。沖(chong)洗畢(bi)，夾(jia)緊蒸(zheng)氣發生器與(yu)收集器之間的連(lian)接橡(xiang)膠管(guan)，由於氣(qi)體冷卻壓(ya)力(li)降(jiang)低(di)，反(fan)應室(shi)內廢液(ye)自動(dong)抽到(dao)反(fan)應室(shi)外殼中，打開廢(fei)液(ye)排出(chu)口(kou)夾(jia)子放出廢(fei)液(ye)。如(ru)此(ci)清(qing)洗2～3次(ci)，再在(zai)冷凝管(guan)下換(huan)放個盛有(you)硼酸(suan)-示(shi)劑(ji)混合(he)液(ye)的錐(zhui)形(xing)瓶使冷凝管(guan)下口(kou)浸沒在溶(rong)液(ye)中，蒸(zheng)餾(liu)1～2min，觀(guan)察錐形(xing)瓶內的溶(rong)液(ye)是否變(bian)色。如(ru)不(bu)變(bian)色，表(biao)示(shi)蒸(zheng)餾(liu)裝置(zhi)內已洗幹(gan)凈(jing)。移(yi)去(qu)錐形瓶，再蒸(zheng)餾(liu)1～2min，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水沖(chong)洗冷凝器下(xia)口，關(guan)閉煤氣(qi)燈(deng)，儀器即可供測樣(yang)品(pin)使用(yong)。

　　2、無(wu)機氮(dan)標準(zhun)樣(yang)品(pin)的蒸(zheng)餾(liu)吸收

　　由於定(ding)氮(dan)操作(zuo)繁(fan)瑣，為(wei)了(le)熟(shu)悉(xi)蒸(zheng)餾(liu)和滴(di)定(ding)的操作(zuo)，初(chu)學者(zhe)宜(yi)用(yong)無(wu)機氮(dan)標準(zhun)樣(yang)品(pin)行反(fan)復練習，再行(xing)有機氮(dan)未知樣(yang)品(pin)的測定(ding)。常用(yong)巳(si)知濃度(du)的標(biao)準(zhun)硫酸(suan)銨(an)測試(shi)三(san)次(ci)。取潔凈(jing)的100mL錐(zhui)形(xing)瓶五只(zhi)，依(yi)次加(jia)入(ru)2%硼酸溶(rong)液(ye)20mL，次甲基(ji)藍(lan)-甲基(ji)紅(hong)混(hun)合(he)示(shi)劑(ji)（呈(cheng)紫(zi)紅(hong)色(se)）3～4滴(di)，蓋(gai)好(hao)瓶口待用(yong)。取(qu)其(qi)中只錐(zhui)形瓶承接在(zai)冷凝管(guan)下端(duan)，並使冷凝管(guan)的出(chu)口(kou)浸沒在溶(rong)液(ye)中。註意：在此(ci)操作(zuo)之前(qian)打開收(shou)集器活(huo)塞，以免(mian)錐形(xing)瓶內液(ye)體倒吸。準(zhun)確吸取2mL硫(liu)酸銨(an)標(biao)準(zhun)液(ye)加(jia)到(dao)玻杯中，小(xiao)心(xin)提(ti)起(qi)棒狀(zhuang)玻塞使(shi)硫(liu)酸銨溶(rong)液(ye)慢(man)慢(man)入(ru)蒸(zheng)餾(liu)瓶中，用(yong)少(shao)量蒸(zheng)餾(liu)水沖(chong)洗小(xiao)玻杯3次(ci)，並放人(ren)蒸(zheng)餾(liu)瓶中。然(ran)後用(yong)量(liang)筒向(xiang)小(xiao)玻杯中加(jia)入(ru)10 mL 30%NaOH溶(rong)液(ye)，使堿(jian)液(ye)慢(man)慢(man)入(ru)蒸(zheng)餾(liu)瓶中，在堿(jian)液(ye)尚未(wei)入時，將棒狀(zhuang)玻塞蓋(gai)緊。向(xiang)小(xiao)玻杯中加(jia)約(yue)5mL蒸(zheng)餾(liu)水，再慢(man)慢(man)打開玻塞，使(shi)半(ban)水入蒸(zheng)餾(liu)瓶，半留(liu)在(zai)小(xiao)玻杯中作(zuo)水封。關(guan)閉收集器活(huo)塞，加(jia)熱(re)蒸(zheng)氣發生器，行(xing)蒸(zheng)餾(liu)。錐形瓶中的硼(peng)酸(suan)-示(shi)劑(ji)混合(he)液(ye)由於吸收了(le)氨(an)，由紫(zi)紅(hong)色(se)變(bian)成綠色。自變(bian)色時起(qi)，再蒸(zheng)餾(liu)3～5min，移(yi)動(dong)錐形(xing)瓶使瓶內液(ye)面離(li)開冷凝管(guan)下口(kou)約lcm，並用(yong)少(shao)量蒸(zheng)餾(liu)水沖(chong)洗冷凝管(guan)下口(kou)，再繼(ji)續(xu)蒸(zheng)餾(liu)1min，移(yi)開(kai)錐形瓶，蓋(gai)好(hao)，準(zhun)備滴(di)定(ding)。在(zai)次(ci)蒸(zheng)餾(liu)畢後，移(yi)去(qu)煤氣燈(deng)，夾緊蒸(zheng)氣發生器與(yu)收集器間的橡(xiang)膠管(guan)，排除(chu)反(fan)應畢(bi)的廢(fei)液(ye)，用(yong)水沖(chong)洗小(xiao)玻杯幾(ji)次(ci)，並將廢(fei)液(ye)排除(chu)。如(ru)此(ci)反(fan)復沖(chong)洗幹(gan)凈(jing)後，即可行(xing)下(xia)個樣(yang)品(pin)的蒸(zheng)餾(liu)。按以上方法(fa)用(yong)標(biao)準(zhun)硫酸(suan)銨(an)再做(zuo)兩次(ci)。另(ling)取2mL蒸(zheng)餾(liu)水代替(ti)標(biao)準(zhun)硫酸(suan)銨(an)行(xing)測定(ding)二次。將(jiang)各次(ci)蒸(zheng)餾(liu)的錐(zhui)形(xing)瓶起(qi)滴(di)定(ding)。

　　3、未(wei)知樣(yang)品(pin)及(ji)的蒸(zheng)餾(liu)吸收

　　將(jiang)消化好(hao)的蛋白樣(yang)品(pin)三支，對(dui)照(zhao)液(ye)三支，依(yi)次作(zuo)蒸(zheng)餾(liu)吸收。加(jia)5mL熱(re)的蒸(zheng)餾(liu)水至消化好(hao)的樣(yang)品(pin)或對(dui)照(zhao)液(ye)中，通過(guo)小(xiao)玻杯加(jia)到(dao)反(fan)應室(shi)中，再用(yong)熱(re)蒸(zheng)餾(liu)水洗滌(di)小(xiao)玻杯3次(ci)，每(mei)次用(yong)水量約3mL，洗滌(di)液(ye)並倒入(ru)反(fan)應室(shi)內。其(qi)余(yu)操作(zuo)按標準(zhun)硫酸(suan)銨(an)的蒸(zheng)餾(liu)行。由於消(xiao)化液(ye)內硫酸(suan)鉀(jia)濃度(du)而(er)呈(cheng)粘(zhan)稠狀(zhuang)，不(bu)易(yi)從凱(kai)氏(shi)燒(shao)瓶內倒出(chu)，加(jia)入(ru)熱蒸(zheng)餾(liu)水5 mL稀釋(shi)之，如(ru)果(guo)有(you)結(jie)晶析(xi)出，微(wei)熱溶(rong)解，趁熱(re)加(jia)入(ru)玻杯，使(shi)其(qi)入(ru)反(fan)應室(shi)。此(ci)外，還(hai)應(ying)當註(zhu)意趁儀器洗滌(di)尚未(wei)冷卻時立即加(jia)入(ru)樣(yang)品(pin)或對(dui)照(zhao)液(ye)，否則(ze)消(xiao)化液(ye)通過(guo)冷卻的管(guan)道容易(yi)析(xi)出結(jie)晶，成(cheng)堵(du)塞(sai)。